Nanoskopie mit fokussiertem Licht
Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie um das Dreißigfache gesteigert, ohne Fluoreszenzmoleküle nacheinander in einen leuchtenden und dunklen Zustand zu schalten.
Die nobelpreisprämierte STED- und PALM/STORM-Mikroskopie sowie andere superauflösende Fluoreszenzmikroskope liefern Auflösungen von einem Bruchteil der Lichtwellenlänge. Doch um benachbarte Fluoreszenzmoleküle getrennt abzubilden, müssen diese nacheinander in einen leuchtenden und einen nichtleuchtenden Zustand überführt werden. Wissenschaftler um Stefan Hell vom MPI für multidisziplinäre Naturwissenschaften haben jetzt die Auflösung um das Dreißigfache gesteigert – und zwar erstmals ohne einen solchen On-/Off-Schalten. Indem sie einen Beleuchtungsstrahl mit einem Intensitätsminimum – einen dunklen Streifen im Strahl – verwendeten, konnten sie Moleküle bis auf einige wenige Nanometer trennen. Die Studie zeigt auch einen Weg auf, wie sich die Auflösungsgrenze nicht nur für fluoreszierende Moleküle, sondern für alle Arten von Wellen und generell für Punktobjekte durchbrechen lässt. In Zukunft könnten sich damit winzige Bewegungen einzelner Proteine filmen lassen.
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Die Überwindung der Auflösungsgrenze im Lichtmikroskop von etwa einer halben Lichtwellenlänge zählt zu den bedeutenden Entwicklungen in der Optik. Aufgrund der Wellennatur des Lichts kann selbst die beste Linse keinen feineren Lichtfleck als einen von 250 Nanometer Durchmesser produzieren. Alle Moleküle, die sich innerhalb dieses hellen Lichtflecks befinden, werden auf einmal beleuchtet, leuchten zusammen auf und erscheinen daher untrennbar als verwaschenes Ganzes. Hell erkannte Anfang der 1990er-Jahre, dass man Moleküle dennoch trennen kann, wenn man das Leuchten dieser Moleküle kurz aus- und einschaltet, und zwar so, dass eng benachbarte Moleküle gezwungen sind, nacheinander zu leuchten. Leuchten Moleküle nacheinander, können sie unterschieden werden. Der Schlüssel zur Überwindung der Auflösungsgrenze war also, die Moleküle kurz zwischen einem leuchtenden On- und einen nicht leuchtenden Off-Zustand zu schalten.
Da sich fluoreszierende Moleküle gut an- und ausschalten lassen, konnte man dieses On-/Off-Prinzip in der Fluoreszenzmikroskopie hervorragend umsetzen und so die Auflösungsgrenze vollständig überwinden. In der Tat beruhen STED und PALM/STORM, wie auch alle späteren superauflösenden Fluoreszenzmikroskope, auf diesem Prinzip. Im Jahr 2014 erhielt Hell sowie die US-amerikanischen Wissenschaftler Eric Betzig und William E. Moerner für die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie den Nobelpreis für Chemie.
Wissenschaftler um Hell und vom MPI für medizinische Forschung haben jetzt gezeigt, dass eine abzählbare Anzahl von Molekülen auch ohne On-/Off-Schalten getrennt werden können. Sie wiesen experimentell nach, dass sich Punktobjekte wie Moleküle bis hinunter zu kleinen Abständen von acht Nanometern klar trennen lassen. Dazu rasterten die Forscher die Moleküle mit einem Lichtstrahl ab, der in der Mitte eine Intensität von Null hat. Mit anderen Worten, im Zentrum des Beleuchtungsstrahls war nicht ein heller, sondern ein dunkler Fleck mit verschwindender Intensität.
Beim Abrastern wird das gemessene Signal – im Falle von Fluoreszenzmolekülen ist es Fluoreszenz – registriert. Für ein einzelnes Fluoreszenzmolekül ist das gemessene Signal Null, wenn sich das Minimum genau über dem Molekül befindet. Sind aber zwei oder mehrere benachbarte Moleküle in der Probe enthalten, so kann das gemessene Signal niemals Null werden. Denn mindestens ein Molekül kann nicht mit der Nullstelle des Beleuchtungslichts örtlich übereinstimmen.
Die Wissenschaftler haben theoretisch und experimentell nachgewiesen, dass sich mit diesem Prinzip des Abrasterns mit einer Intensitäts-Nullstelle sehr genau die Orte der Moleküle bestimmen lassen. Den Forschern gelang es, zwei permanent emittierende Fluorophore in einem Abstand von hinunter bis zu acht Nanometern zu trennen und auch eine Gruppe von drei oder vier Molekülen mit Abständen von etwa zwanzig Nanometern aufzulösen. „Das On-/Off-Schalten gilt seit der Einführung des STED-Prinzips vor über drei Jahrzehnten als notwendige Voraussetzung für optische Hochauflösung. Daher ist das nun beschriebene und experimentell validierte Konzept ein Durchbruch“, erklärt Hell.
Mit diesem neuen Konzept ist es prinzipiell sogar einfacher, näher beieinander liegende Moleküle räumlich zu registrieren als weiter entfernte. „Das war nicht unbedingt zu erwarten, denn es stellt das intuitive Verständnis für Auflösung auf den Kopf“, bemerkt Team-Mitglied Thomas Hensel Denn bisher galt: Je enger die Moleküle zusammen sind, desto schwerer sind sie aufzulösen. Wenn man wie bisher mithilfe von hellen Lichtflecken trennt und Signalmaxima produziert, so kann man diese aufgrund des Signalrauschens der jeweiligen Moleküle nur schwer auseinanderhalten. „Arbeitet man mit einem dunklen Fleck und untersucht die Abweichung des erhaltenen Signals von Null, ist das quasi umgekehrt“, ergänzt Hell.
Für ihre Ergebnisse sehen die Wissenschaftler ein breites Potenzial. „Die Idee der Auflösung mit dem Minimum ist nicht nur für fluoreszierende Moleküle anwendbar, sondern für Punktobjekte ganz generell. Und auch nicht nur für optische Wellen, also Licht, sondern prinzipiell für alle Wellen“, so Hell. Auflösen ohne On oder Off ist wichtig, weil so alle Moleküle ohne zeitliche Unterbrechung beobachten werden können – und das bei kleinsten Abständen.
Das eröffnet eine weitere Anwendung: Werden molekulare Maschinen, die aus einer Vielzahl von Proteinen bestehen, an unterschiedlichen Stellen mit konstant leuchtenden Molekülen markiert, können Forscher deren zeitliche Positionsveränderung auf kleinstem Raum verfolgen. Winzige Bewegungen von molekularen Maschinen wären so filmbar. Dies könnte helfen, zukünftig Medikamente zu entwerfen, die diese Proteine – je nach Bedarf – am Ausüben ihrer Funktion hindern oder sie dabei unterstützen. Indem die Mikroskopiemethode Einblicke in die Funktionsweise von Proteinen gewährt, könnte sie die Entdeckung von Medikamenten sogar beschleunigen.
MPI-NAT / RK
